Эколого-биологический центр

Биология дрозофилы.

Дрозофила (Drosophila) – насекомое, из семейства двукрылых . Русское название этого насекомого – плодовая мушка, мелкие насекомые (длиной до 3,5мм) с вздутым телом и обычно красными глазами. Дрозофилы – мелкие мушки без аллейки лобных щетинок, но с вибриссами, костальная жилка с 2 перерывами, распространены во всем мире. В России около 25 видов. Встречаются повсеместно: преимущественно в бродящих, часто полужидких растительных остатках, винных погребах, вытекающем соке растений. Личинки развиваются в разлагающихся растительных остатках или минируют листья. В естественных условиях дрозофилы имеют значение как переносчики дрожжевых грибков.

В качестве объекта генетических и экологических исследований во многих лабораториях мира широко используется плодовая мушка – дрозофила (Drosophila melanogaster) из отряда Diptera. Она имеет малые размеры, величиной примерно 3 мм с ярко – красными и серыми глазами и серым телом.

Особенности дрозофилы, как объекта исследования являются:

1) малый срок развития от яйца до взрослой мухи (10 – 12 дней);

2) высокая плодовитость;

3) большое количество полученных мутагенных линий;

4) малое число хромосом;

5) доступность разведения в любых лабораториях, включая школьные.

В лабораторных условиях оптимальной температурой считается

+24-25 С, при которой цикл развития дрозофилы от яйца до взрослой мухи равен 10 суткам. При температуре + 27 С цикл развития сокращается до 9 суток. Развитие яйца длится примерно сутки, а развитие личинки и куколки длится 4-5 суток. За год можно получить около 40 поколений дрозофилы. При низких температурах, около + 10 С личиночный период длится около 2-х месяцев, а куколочный – 13 –14 дней. Продолжительность жизни взрослой мухи в лабораторных условиях равна 1 месяцу, что зависит от температуры, пищи, влажности, плотности населения и т. д. В специальных опытах дрозофила жила 153 дня.

Жизненный цикл развития дрозофилы.

Оплодотворённая самка дрозофилы откладывает на питательную среду яйца, вытянутые, длиной примерно 0,5 мм. , которые видны невооружённым глазом поблизости от стенок пробирки. Яйцо дрозофилы защищено двумя оболочками: внутренней – желточной, и наружной – хорионом. Хорион образует два выроста – филаменты, которые предохраняют яйцо от погружения в жидкую среду. На переднем конце яйца имеется отверстие – микропиле, служащие для проникновения в него сперматозоида. Примерно через 24 часа из яйца выходит личинка. Ползает по питательной среде, обильно питаясь, затем погружается вглубь и выходит на стенку пробирки перед окукливанием. Переходя в стадию куколки, она приобретает боченкообразную форму и фиксируется на стенке пробирки. На стадии куколки происходят сложные процессы метаморфоза, когда все органы и ткани, кроме нервной и половой, претерпевают обратное развитие и замещаются другими, которые формируются из определённых зачатков эмбриональной ткани, называемой имагинальными дисками, или примордиев. К концу третьего дня через покров куколки видны очертания глаз, а через сутки ещё – все очертания органов мухи. Выход мухи из покровов куколки происходит благодаря разрыву оболочки в области лобного пузыря, когда муха выделяет капельку жидкости. Вышедшая из оболочки муха слабо пигментирована, имеет смятые крылья, однако, часов через шесть она приобретает фенотип взрослой мухи. Через 12 часов дрозофила становится половозрелой и может копулировать. После оплодотворения через сутки, самка откладывает яйца, цикл повторяется. Одна самка откладывает от 200-300 яиц, а в оптимальных условиях до 2000 (в опытах Бриджеса).

Морфология дрозофилы.

Самки и самцы дрозофилы несколько отличаются по ряду морфологических признаков.

Самки несколько крупнее самцов.

Брюшко у самки несколько округлое, с заостренным концом. У самца оно более цилиндрическое, с притупленным концом (округлое).

У самки имеется восемь хорошо видимых темных пластинок (тергитов), у самца их шесть, два последних слиты и образуют широкую полосу со спинной стороны.

У самцов на первом членике лапки передних ног имеются половые гребешки, состоящие из хитиновых щетинок, служащие для удержания самки во время копуляции.

Наружные половые органы самки состоят из влагалища, по сторонам которого расположены две вагинальные пластинки, а сзади них – анальный бугорок, состоящий из двух анальных пластинок. Наружные половые органы самца состоят из генитальной пластинки и пениса с прилегающими к нему частями. (приложение №3)

Методы биотестирования и зооиндикации в экологическом мониторинге.

Для оценки воздействия загрязнителей на компонент экосистем необходимо использовать не только растительные (относящиеся к продуцентам), но и животные (представляющие консументов) тестобъекты. С помощью последних возможна оценка степени аккумуляции и биотрансформации поллютантов в большем количестве звеньев трофических цепей.

Биоиндикация с использованием животных может быть пассивной или активной. В первом случае в полевых условиях измеряются параметры жизнедеятельности аборигенных видов (или их сообществ), выбранных в качестве биоиндикаторов. Во втором - степень антропогенного изменения (загрязнения) экосистем определяется по реакции тест – организмов, помещенных в стандартизированные условия либо на исследуемой территории, либо в лаборатории. При пассивной биоиндикации виды животных – индикаторов выбираются с учетом разных их характеристик: доступности для исследования, широты распространения, способности к аккумулированию загрязнителей, подвижности (оседлости) и т. д. , в зависимости от задач проводимого биомониторинга.

Метод биотестирования с помощью модельных микропопуляций дрозофилы (Drosophila).

Дрозофила (Drosophila) является классическим объектом генетических и эколого-генетических исследований. Поэтому модельные микропопуляции дрозофилы удобно использовать для экспериментов по выявлению загрязнителей на организм насекомых, их популяций, для тестирования и биоиндикации различных компонентов экосистем. Метод биотестирования и биоиндикации с помощью дрозофилы заключается в культивировании ее модельных микропопуляций на питательной среде, в которую добавлен тестируемый субстрат. В зависимости от целей исследования длительность эксперимента может быть различной (от 24 часов до нескольких недель, если необходимо оценить мутагенную активность субстрата и проследить за динамикой признаков в ряду поколений мух).

Материалы и оборудование.

Стеклянные пробирки диаметром 28-30 мм

Бинт и вата

Стеклянные воронки

Мерный стакан

Компоненты среды: сахар, манка, дрожжи, желатин (или агар – агар)

Приготовление водной вытяжки.

Для приготовления водной вытяжки воздушно-сухую почву измельчают в ступке и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

Навеску почвы 50 г. переносят в колбу объемом 1 литр и приливают 500 мл. кипячёной дистиллированной воды, закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 4 –5 минут.

Полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр. Если фильтрат оказывается мутным, то фильтрование повторяют.

Рецепт питательной среды.

На 33 пробирки:

*Воды – 233 мл

*Агар – агара – 3 г (15 г желатина)

*Пекарских дрожжей САФ (сухих) – 4 г

*Манной крупы – 8 г

Варка питательной среды.

Варить среду рекомендуется в алюминиевой посуде. В эмалированной посуде среда, как правило, пригорает.

Все составные части среды отвешивают на технических весах. К навеске агара (предварительно замоченного и набухшего желатина) подливают соответствующее количество холодной воды и при периодическом помешивании доводят до кипения и до растворения агара.

В кипящий раствор агара прибавляют дрожжи, вновь доводят до кипения и при постоянном помешивании кипятят на слабом огне ещё 40 минут.

Во время кипения в открытой кастрюле вода испаряется, и по мере выкипания добавляют горячую воду до первоначального объема. Затем, прибавляют сахарный песок и манную крупу при постоянном помешивании, чтобы не образовались сгустки манной крупы, и не было пригорания; доводят до кипения еще 15 минут. После окончания варки охлаждают до 60 – 70 С и разливают в пробирки при помощи обыкновенной воронки диаметром около 15 см с натянутой на конец резиновой трубкой, на которую надет зажим Мора. Воронку укрепляют на штативе. Охлаждение необходимо, т. к. горячую среду трудно равномерно разлить в пробирки; кроме того, среда долго остывает, и стенки сильно запотевают.

После полного охлаждения среды в пробирках производят засев (смазывание) её поверхности дрожжами. Для смазывания берут только пекарские дрожжи, которые разбавляют в водопроводной воде, а лучше в дистиллированной воде и наносят тонким слоем при помощи кисточки на среду в пробирку так, чтобы вся поверхность была смазана равномерно.

Смесь дрожжей по консистенции должна напоминать молоко.

Подготовка мух и постановка опытов.

После спаривания сперма может сохраняться в сперматеке самки в течение нескольких суток. Поэтому, для скрещивания необходимо брать только виргинных самок, не старше 10 –12 часов после вылупления. Для этой цели из культур, из которых хотят взять виргинных самок, за сутки до начала выхода мух, удаляют родительские особи. Получение девственных самок в пределах указанных сроков рекомендуется особенно начинающим, так как большая часть неудач в их опытах связана с несоблюдением именно этих условий.

В каждую пробирку, емкостью около 100 мл. с 25 мл. питательной среды сажают 3-4 самки, число самцов не влияет на плотность населения в культуре, их можно брать больше. Кладка яиц начинается с конца вторых суток после рождения мухи и продолжается в течение всей жизни. Одна самка откладывает около 200-300 яиц. Кладка яиц лучше происходит на среду, где хорошо проросли дрожжи. Заготавливать пробирки с кормом надолго не рекомендуется, а готовые с кормом пробирки хранят в холодильнике.

Обращение с дрозофилой.

Исследование признаков дрозофил проводится под наркозом. Для наркоза лучше использовать серный эфир, в крайнем случае – хлороформ, так как мухи хуже его переносят.

Перетряхивание мух из культуры в морилку и наркотизирование требует навыков и выполняется следующим образом. Осторожным встряхиванием или постукиванием пальцами о стенки стаканчика перегоняют мух подальше от пробки, затем быстро открывают ее и так же быстро приставляют к отверстию стаканчика (морилки). Легким постукиванием о стенки стаканчика стряхивают в морилку оставшихся мух и закрывают пробками, сначала морилку, затем исходную.

Как только мухи перестают двигаться, их вытряхивают из морилки на стекло. От большой дозы наркоза они быстро погибают, о чем можно судить по растопыренным кверху и в стороны крыльям и вытянутым лапкам. Ватка, поэтому, должна быть смочена эфиром слегка. Анализ мух проводят либо с помощью лупы, либо бинокуляра, когда требуется детально рассмотреть оттенки окраски глаз, тела и др. Если во время просмотра мухи начинают просыпаться от наркоза, их надо вновь поместить в морилку или дать небольшую дозу эфира крышкой от морилки.

Результаты и их обсуждение.

Мы обозначили МП – А пробирки, среда которых сварена на вытяжке почвы из района пионерского парка; МП – В пробирки, среда которых сварена на вытяжке почвы из района больницы №2; МП – Г пробирки, среда которых сварена на дистиллированной воде; МП – Д пробирки, среда которых сварена на вытяжке почвы из Сеченовского района Нижегородской области. Пробирки МП – А и МП – В исследуемые пробирки, пробирки МП – Г и МП – Д контрольные пробирки.

Мы проводили скрещивания на питательных средах в пробирках, данные заносили в таблицу (приложение №1). Краткая таблица представлена ниже.

Таблица №1

Экспериментальные данные 2005 года.

Микропопуляции Куколки Имаго

1 подсчёт 2 подсчёт

Всего пробирок МП – А – 3 шт. В 1,7 2,7 -

среднем в одной пробирке МП – А

Всего пробирок МП – В – 2 шт. В 20 50 21,5

среднем в одной пробирке МП - В

Всего пробирок МП – Г – 19 шт. В 56,68 96,11 77,42

среднем в одной пробирке МП – Г

Всего пробирок МП – Д – 2 шт. В 44 97,5 52

среднем в одной пробирке МП - Д

Из сведений таблицы получаем, что на питательной среде, сваренной на вытяжке почвы из парка - мухи не развиваются, на питательной среде сваренной из вытяжки почвы района больницы №2 мухи плохо развиваются. Однако в пробирках, среды которых сварены на вытяжке почв Сеченовского района и на дистиллированной воде мухи развиваются одинаково хорошо. На основе проделанной нами работы можно предположить, что: а) в районе парка и больнице №2 присутствует растворимый в воде загрязнитель, подавляющий рост и развитие плодовой мушки дрозофилы.

б) вдали от города (Сеченовский район) загрязнителей нет, так как показатели развития мух практически одинаковы.

Таблица №2

Характеристика загрязнения воздуха на исследуемых участках города Дзержинска по данным Комплексной Лаборатории Мониторинга Окружающей Среды (КЛМОС) 2005 года.

Примесь Пионерский парк (qср) Больница №2 (qср)

Диоксид серы 0,004 0,005

Оксид углерода 0,0 1,0

Диоксид азота 0,05 0,04

Аммиак 0,05 0,06

Фенол 0,002 0,002

Формальдегид 0,005 0,006

Хлористый водород 0,03 0,04

Хлор 0,0 0,0

Бензол 0,07 0,05

Ксилол 0,03 0,03

Этилбензол 0,01 0,01

Толуол 0,12 0,1

Циклогексанон 0,01 0,01

Циклогексанол 0,01 0,01

После сравнения данных КЛМОС с полученными нами в эксперименте мы видим, что уровень загрязнение воздуха и почвы в районе пионерского парка выше, чем в районе больнице №2.

Таблица №3

Экспериментальные данные 2006 года

Микропопуляции Куколки Имаго

1-й подсчёт 2-й подсчёт

Всего пробирок МП-А 4 шт. В среднем 0,75 1,75 0

в одной пробирке МП-А.

Всего пробирок МП-Г 15 шт. В среднем53,27 93,24 77,56

в одной пробирке МП-Г.

К сожалению, нам не удалось повторить эксперимент 2005 года в полном объёме. Результаты сравнения данных таблиц №1 и №2 говорят об ухудшении экологического состояния в районе пионерского парка.

Таблица №4

Характеристика загрязнения воздуха в пионерском парке города Дзержинска по данным Комплексной Лаборатории Мониторинга Окружающей Среды 2005 и 2006 года.

Примесь Пионерский парк 2005 год (qср). Пионерский парк 2006 год (qср).

Диоксид серы 0,004 0,005

Оксид углерода 0,0 1,0

Диоксид азота 0,05 0,05

Аммиак 0,05 0,05

Фенол 0,002 0,005

Оксид азота 0,03 0,03

Формальдегид 0,005 0,004

Хлористый водород 0,03 0,04

Хлор 0,0 0,0

Бензол 0,07 0,05

Ксилол 0,03 0,05

Этилбензол 0,01 0,01

Толуол 0,12 0,13

Циклогексанон 0,01 0,01

Циклогексанол 0,01 0,01

По данным Комплексной Лаборатории Мониторинга Окружающей Среды основными источниками загрязнений воздушного бассейна города являются выбросы автотранспорта и крупные промышленные предприятия.

Сравнивая результаты эксперимента и данные КЛМОС получаем, что методика биотестирования с помощью плодовой мушки дрозофилы объективно показывает изменение экологического состояния окружающей среды.

1. Изучили методику биотестирования с помощью плодовой мушки дрозофилы.

2. Провели скрещивание плодовой мушки дрозофилы с использованием сред, приготовленных на вытяжках разных почв.

3. Результаты показали, что на питательной среде сваренной на вытяжках почвы городской среды мухи не развиваются или развиваются плохо. В то же время на питательной среде, приготовленной из вытяжки почвы Сеченовского района Нижегородской области, имаго образовывалось почти столько же, сколько и на дистиллированной воде.

4. Можно предположить, что почва городской среды содержит растворимые загрязнители, неблагоприятно влияющие на развитие мушек.

5. По данным Комплексной Лаборатории Мониторинга Окружающей Среды вырос уровень загрязнения воздуха на исследуемых участках города следующими веществами: диоксидом серы, оксидом углерода, фенолом, хлористым водородом, ксилолом, толуолом

6. Основной вклад в ухудшение экологического состояния города вносят выбросы автотранспорта и промышленных предприятий.

7. Методика биотестирования с помощью плодовой мушки дрозофилы объективно показывает изменение экологического состояния окружающей среды.